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1.标记DNA探针每次标准的反应可标记10ng至3线性的DNA,也可标记更大量的DNA,但所有的成分和体积要相应增加。
(1)DNA探针热变性,煮沸10min,迅速冷却于冰/乙醇中5min以上,待用。
(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及试剂:
新鲜变性的DNA1-3
六聚核苷酸混合物2(管5)
dNTP标记用混合底物2(管6)
加无菌重蒸水至19
DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)1(管7)
(3)在37℃保温至少60min,可到20h。
(4)煮沸5min,终止反应。
(5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。
2.预杂交按100cm2膜用20~40ml预杂交溶液,预杂交时使溶液处于流动状态。
预杂交液组成:5㗓SC
0.5%(W/V)封阻试剂(管11)
0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%(W/V)SDS
膜放入塑料袋,灌入预杂交液,排除气体后密封,在65℃预杂交过夜。

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