2014-10-12【求助】mTOR转膜不完全的原因，半干式转膜仪，急需解决

个人建议时间不要再长了，再长蛋白有可能变性造成后续实验无法进行。我原来遇到这类问题是用以下几种方法尝试解决的，你也可以尝试一下（1）检查一下你的三明治结构夹的怎么样，尤其是膜及滤纸的边缘是不是有短接的地方，这个是最容易出现的问题。另外膜和胶之间是不是有气泡，不推荐用外力去擀压膜和胶，推荐用缓冲液润湿膜和胶之后，像做切片盖盖玻片一样从一边盖下赶出气体。要绝对确保没有短接和气泡，不然很容易出现转膜不完全的问题。（2）换成恒压的试试，这个方案我不知道原理是什么，但是有的时候确实能够解决问题。（3）换成半干转的方法，但是注意半干转更要确保没有短接气泡，而且时间不能过长，半干转的发热量很大。我不清楚你的蛋白是不是需要活性，如果遇热失活那就不能用这种方法。（4）这个方法比较浪费，看老板让不让你用了。换成品缓冲液商品，西格玛的比较好。另外换24层滤纸成品，用一次不要再使用第二次。还有就是还一个牌子的膜，我们实验室曾经遇到过一个牌子的膜完全转不出来的现象。以上，希望你的问题早日能够解决。

就是转完膜后，发现膜上有Marker，但胶上也有，而小分子量的用90分钟，胶上的marker已全部转到膜上了。

289KDa，最好用湿转，低电压过夜，转膜液最好用新的，可以加点SDS。

我们实验室没有湿转的机子，要不我会这么难受吗，但我看用半干有做出来的，所以想请教下，急于毕业，但是这个做不出来，非常焦急

电流我加大了，转膜的时间也加大了，但是还是不行，我真的希望做过这封面的哥们给支下招

完了，只用过湿转做mTOR，分子量太大了!湿转条件：350mA，75min

tigertang289KDa，最好用湿转，低电压过夜，转膜液最好用新的，可以加点SDS。请问要加多少SDS