一、灌制平板胶

1.清洗玻璃板。

a.将玻璃板放人2%PCC-54清洗液中浸泡3?24h。

b.自来水彻底冲洗玻璃板后，再用蒸馏水清洗一遍。

c.玻璃板用干净纸巾擦干后，再用浸过甲醇的Kunwipes纸巾擦拭，空气中晾干。

2.安装凝胶模具组件。

a.将间隔片放在两块玻璃板之间形成三明治模式，用夹子夹好。

b.调整玻璃板和间隔片的底部，使之处于同一水平面，夹紧夹子。

c.把b中做好的凝胶三明治夹板放到模具架上。

d.插人Teflon样品梳，在低于梳齿底部约1.0?1.5cm处做好标记在此以Proteannxielectrophoresisunit(Bio-Rad)为例说明凝胶模具组件安装过程。安装完成后的照片见图2.6a?f。

3.灌制分离胶。

a.参考表2.2(见本章引言）确定所用的丙烯醜胺浓度。

b.按照表2.4的配方配制合适的分离胶。在加TEMED之前应确保溶液已经充分混匀。

c.用IOml移液器将混合好的溶液加入玻璃板夹层中至标记线高度(步骤②d中做好的标记线）（见图2.6)。

d.小心地在凝胶上覆盖一层约2mm高的水或水饱和的正丁醇或异丙醇溶液。这是为了防止空气与凝胶接触后抑制凝胶的聚合，并保证凝胶表面水平。

e.聚合完全后（约需30min)，倒掉凝胶上层的水，用滤纸仔细将剩余的水吸干，注意勿破坏凝胶表面。如果凝胶上层铺的是正丁醇（或异丙醇），将液体吸干后，应用水冲洗凝胶表面。

若在凝胶和上层液相之间可看见一清晰的折射率变化，则说明凝胶已经聚合。

4.灌制浓缩胶。

a.为浓缩胶选择一合适的丙烯酰胺浓度，按表2.5的配方依次混匀各成分。

b.在分离胶上铺浓缩胶至浓缩胶高度为2.0?3.0cm。

c.将梳子插入铺好的浓缩胶溶液，保持梳齿底部与分离胶上沿距离1.0~1.5cm，注意梳齿下面不应有气泡藏匿。以一定角度将梳子插入浓缩胶能减少气泡产生的可能性。若有气泡形成，可轻拍气泡周围的玻璃板将气泡排出。

d.让浓缩胶聚合约2h。梳子边缘的折射率变化表明胶已经制备好。这时最好在玻璃板上对应样品孔底部用记号笔做好标记。

5.小心地拔出梳子，按厂商给出的说明将凝胶模具安装到电泳装置内。

6.将电泳缓冲液倒入上槽，并确保缓冲液没过上样孔，从槽上方检查有无渗漏。

如果没有渗漏，在下槽中也加人电泳缓冲液，倾斜整个装置以赶出凝胶下面可能留有的气泡。

另一种排除气泡的做法是用一根长的弯针或钩状的巴氏吸管在吸取电泳缓冲液后喷向凝胶底部边缘。排完气泡后就可以上样了。

二、样品的制备

进行步骤7或步骤8。

7.制备蛋白溶液。

a.将蛋白质溶液和2XSDS-PAGE上样缓冲液以I:1混合。在理想情况下，SDS和多肽结合的比例是每克多肽1.4gSDS，但为了保证有足够量的SDS，蛋白质的终浓度不应高于10jug/julD实验提示：将整个样品都上样时，切记样品的体积（也就是蛋白质溶液和上样缓冲液的总体积）不要超过上样孔的容积。

b.用电加热块（heatblock)或水浴装置加热样品，95°C保持2min，使蛋白质变性，并确保蛋白结合最大量的SDS。样品冷却至室温后，离心去除不溶物。

8.制备细胞总蛋白样品。

a.涡旋制备好的细胞团块使之松散。

b.直接加人2XSDS-PAGE上样缓冲液，涡旋混合。

这时的细胞裂解液相当黏稠。加人的上样缓冲液的量取决于所研究的细胞株。但一般以每IXlO5个细胞用IOOpl为宜。最佳使用量还需试验决定。

实验提示：将整个样品都上样时，切记样品的体积（也就是蛋白质溶液和上样缓冲液的总体积）不要超过上样孔的容积。

C.将细胞裂解液于IOOOOOg离心2〇min，收集上清。

从一定数目的细胞中得到的蛋白质浓度会因采用的细胞株不同而有所差异。如果蛋白浓度超过lOyg/rl，应直接加SDS粉末，即使终浓度为5%的SDS也不会干扰电泳分离。

d.用加热块或水浴装置加热样品，95。(：保持2min，使蛋白质变性，并确保蛋白结合最大量的SDS。样品冷却至室温后，离心去除不溶物。

三、进行不连续平板凝胶电泳

9.使用移液器和上样吸头将样品加人上样孔中。

10.将电泳装置与电源连接，正极接下槽、负极接上槽。

11.接通冷却系统保持8°C，维持恒压200V，或者在室温维持恒压90V直至溴酚蓝前沿到达凝胶底部。这需要6?8h(恒压200V)或16?18h(恒压90V)。

12.关闭电源，断开电极。从装置中取出凝胶板，小心移去间隔片。用间隔片轻轻撬开凝胶板，让凝胶附着在其中一块板上。

13.选用一种合适而灵敏的染色方法使蛋白质显现。

若要采用与蛋白质的质谱鉴定兼容的染色方法，参见方案2(考马斯亮蓝染色）和方案7(银染）