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前几天我在稀释引物时,被老师看到我正在用漩涡振荡器震荡稀释过的100uM的引物,老师说不能强烈震荡,容易把DNA振断,那请问大家该用什么方法充分混匀?
另有一个问题:2OD的引物,是(1)全部稀释成5uM后4度保存还是(2)稀释成100uM先保存,等到用的时候再稀释成5uM?哪个更好?谢谢大家
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回复:时间:2008-01-26
溶解引物干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,3000-4000转/分钟,1分钟,防止开盖时引物散失。 根据计算出的体积加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。保存引物引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。引物的浓度溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmol/ml或20 pmol/ml)后进行实验。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。
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回复:时间:2008-01-29
1.可以漩涡振荡,引物很短没问题的,超过1Kb以上的最好不要。2.引物稀释,5uM?是不是太低了?我一般先配成100uM的储存液,然后1:5稀释成20uM的工作液,0.25+0.25/25ul体系,终浓度0.2uM。3.反复冻融对引物影响倒不是很大,但是容易污染,所以建议分装。
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