一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（包含所有4种dNTP，各10mmol/L)

2.酶和酶缓冲液

PCR反应缓冲液，10X

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

3.核酸和寡核苷酸

DNA样品（即方案2第16步中的各消减样品）

嵌套PCR引物NP1(10umol/L)

嵌套PCR引物NP2R(10umol/L)

PCR引物PI(10umol/L)

来自方案1第4阶段第8步的未消减检测者对照

4.专用设备

热循环仪，预设至72°C

5.附加试剂

2%琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.初级PCR

（1）每个稀释的DNA样品（即方案2第16步中的各消减样品，以及方案1第4阶段第7步中相应的稀释但未消减的检测者对照），各取1ul分装到准确标记的离心管中。冷冻的样品应该解冻，并在72°C温育，然后吹吸混匀再使用。

（2）另取一个离心管，为所有的初级PCR管配制一个主体混合液。按照下面的顺序将试剂混合。

灭菌水                                 19.5ul
PCR反应缓冲液，10X           2.5ul
dNTP溶液（10mmol/L)          0.5ul
PCR引物PI(10pmol/L)          1.0ul
50X聚合酶混合液                  0.5ul
总体积                                    24.0ul

（3）取24ul主体混合液，分装到第1步准备的各反应管中。

（4）用1滴矿物油覆盖。

（5）在热循环仪中，将反应混合液74°C温育5min，以延伸接头。这一步「填充」接头所缺失的链，因而产生了PCR引物的结合位点。不要将样品从热循环仪中取出。

（6）立即开始下面的循环。



（7）从每个管中取4ul,在2.0%琼脂糖TAE凝胶上分析。
对于某些复杂的消减（复杂的组织或其核基因钽），建议分两步进行初级PCR,这样可以显著降低背景。首先，进行本方案所描述的初级PCR,然后按照方案4第1阶段笫10步所描述的步骤再进行一次初级PCR。最后再逬入次级PCR(方案3)。

2.次级PCR

（8）每个初级PCR产物各取2ul,用38ul水稀释。

（9）从第1步稀释的各初级PCR产物中，各取lul，加到标记好的离心管中。

（10）按照下面的顺序将试剂混合，为次级PCR及一个附加反应的样品配制主体混合液。

灭菌水                      18.54ul
PCR反应缓冲液，10X                   2.5ul
嵌套PCR引物NH(10umol/L)        1.0ul
嵌套PCR引物NP2R(10umol/L)    1.0ul
dNTP溶液（10mmol/L)                0.5ul
50X聚合酶混合液                          0.5ul
总体积                                            24.0ul

（11）将24ul主体混合液分装至第2步的各反应管中。

（12）用1滴矿物油穎盖。

（13）立即开始下面的循环。



（14）从每个管中取4ul，在2.0%琼脂糖TAE凝胶上分析。

（15）反应产物应保存在-20°C。现在，这个PCR产物就富集了差异DNA。

如果不需要MOS,就可以直接进入「消减DNA的克隆」这一部分。