一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

溴化乙锭

Taq延伸PCR添加剂（Stratagene)

Tween20，10%溶液

2.酶和酶缓冲液

dNTP溶液（包含所有的4种dNTP，每种都是25mmol/L)

PCR缓冲液，10X,用户买热稳定聚合酶时公司一并提供，或者PCR优化缓冲液，比如，Opti-PrimePCR优化试剂盒（Stratagene)，以及PCROptimizer(Invitrogen)

热稳定DNA聚合酶（5~10U)，比如，TaqDNA聚合酶，克隆化的PfuDNA聚合酶(Stratagene)

3.核酸和寡核苷酸

可选择：插入物特异的引物（在双向克隆中用来确定插入物的方向）

一套筛选重组体的引物

4.专用设备

用于划板和接菌的无菌枪头

用枪头代替牙签，是因为牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。

5.額外项目

琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭

二、方法

1.根据反应数目或要做的PCR反应的管数，在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备

PCR「鸡尾酒」式混合物，按如下顺序依次加入各种成分。

H₂O将终体积补充到25ul

Taq缓冲液，10X                                                2.5ul

Tween20(体积分数10%溶液）                                1.0ul

dNTP混合物（每种dNTP为25mmol/L)                    0.2ul

重组体筛选引物套（100ng/ul)                                    1ul

Taq延伸PCR添加剂（5U/ul)                                    0.25ul

TaqDNA聚合酶（5U/ul)                                             0.25ul

2.在冰上，分装"鸡尾酒"式PCR混合物到每一个PCR试管中，每管移取25ul。

3.对照反应中，加入1ul的非重组DNA。
可以选择：对于用来确定插入方向的反应，向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。

4.对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于PCR介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。

5.轻轻混匀每个反应体系。

6.用推荐的循环参数进行PCR。

7.用标准的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。推荐用10~15g/L琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp的PCR产物。通常，取1~5ulPCR产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。