一、材料

1.缓冲液和溶液

醋酸氨（10mol/L)

牛血清白蛋白（10mg/ml)

乙醇

溴化乙啶（10mg/ml）或SYBRGold染液

NA终止/贮存缓冲液（50mmol/LTris-Cl(pH7.5)，50mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA(pH8.0)，0.5%(m/V)SDS）

5X随机引物缓冲液（250mmol/LTris(pH8.0)，25mmol/LMgCl₂，20mmol/LDTT，未标记的dNTP各2mmol/L，1mol/LHEPES(用4mol/LNaOH调至pH6.6），1mg/ml长度为6个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物）

2.酶和缓冲液

大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段

3.凝胶

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶

4.核酸和寡核苷酸

长度为6或7个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125ng/μlTE，pH7.6)

模板DNA

5.放射性复合物

[α-³²P]dNTP(10mCi/ml，比活性>3000Ci/mmol）

6.专用设备

沸水浴

SephadexG-50离心柱，用TE(pH7.6)平衡

二、方法

1.电泳后用溴化乙锭（终浓度0.5μg/ml）或SYBRGold染胶，切下所需条带，尽可能切去多余的凝胶。

2.将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中，称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水3ml。

3.将微量离心管放在沸水浴中煮7min以使凝胶融化，同时也使DNA变性。

如立即进行标记，可将离心管置于37℃，直至需要加入模板；否则可贮存于-20℃。但每次从-20℃取出后，含DNA的凝胶团要在100℃加热3~5min，然后置于37℃直至放射性标记反应开始。

4.将一个新的微量离心管置于37℃水浴或加热板上，按下列次序加入：

5X寡核苷酸标记缓冲液      10μl

10mg/ml牛血清白蛋白溶液     2μl

DNA(体积不超过32μl）        20~50ng

10mCi/ml[α-³²P]dNTP          5μl

(比活性>3000Ci/mmol）

Klenow片段（5单位）           1μl

水                                          加至50μl

用微量加样器彻底混合各组分，于室温温育2~3h或37℃温育60min。

5.在反应液中加入10μlNA终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。

贮存放射性标记的探针于-20℃以备杂交用。

或

通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的dNTP或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的DNA。如果>50%的放射性dNTP已在反应中掺入，可不进行该步骤。