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mayitao
/发布时间:1559716430 /浏览量:41
| 实验方法原理 | 发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNAladder）。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 凋亡细胞 试剂、试剂盒 | 蛋白酶K醋酸钾白细胞裂解液Tris-HClNaClEDTASDS乙醇琼脂糖 仪器、耗材 | 离心管离心机水浴锅电泳仪电泳槽
实验步骤 | 一、材料与试剂准备 1. 材料：凋亡细胞。 2. 蛋白酶K（500μg/ml），醋酸钾氯仿（8mol/L），无水乙醇，70%乙醇，2%琼脂糖凝胶。 3. 白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/LTris-HCl，10mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，1%SDS。 二、操作步骤 1. 收集凋亡细胞：取1～2×106个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h。 2. 洗涤：取出酒精固定的细胞，1000r/min离心5min，去掉上清液，PBS洗二次。 3. 裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜。 4. 蛋白处理：加75μl8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10 min后，将上清移至一新的Eppendorf管中。 5. 沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10 min，去上清。 6. 洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min离心5min，去上清。 7. 溶解DNA：根据DAN沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解。 8. 测定DNA浓度。 9. 2%琼脂糖凝胶电泳80V2小时。 三、结果判断 出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200bp，其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。
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