用淋巴细胞分离液分离单个核细胞

1）分离外周血中的单个核细胞（PBMC）

1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。

2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液），混匀后离心200×g10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用1％台盼蓝染色检测细胞活力（应>95％）并计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×10⁶～2×10⁶PBMC。

2）分离关节滑液中的单个核细胞

1．将关节滑液置含肝素（终浓度5IU/ml）的离心管中，离心1000×g15分钟。

2．用含2％灭活小牛血清的Hanks液悬浮沉淀细胞并洗涤细胞1次，每次离心1000×g15分钟。用含2％灭活小牛血清的Hanks液悬浮细胞至原容量。

3．用淋巴细胞分离液分离关节滑液中的单个核细胞，并用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

3）分离组织中的单个核细胞

1．取外科分离的各种组织，用含1％庆大霉素和1％小牛血清的MEM培养液洗涤组织块，洗去可能的污染物。将组织块置培养皿中，加入约为组织块体积5～10倍的同样MEM培养液。用无菌外科剪刀将组织块剪碎成0.5mm³大小。

2．将组织块转移到小培养瓶中，静置片刻，吸去培养液。加入约2倍组织块体积的、滤过除菌的酶溶液。37℃水浴摇床中消化1～2小时，注意组织块的消化程度。

3．当组织块消化分散后，用手用力摇晃培养瓶3～5分钟或用大口吸管反复吹打，使细胞团进一步分散。加入30ml上述MEM培养液，终止酶反应。

4．让上述悬液通过200目的金属网或尼龙网，分离单个细胞。用上述MEM培养液洗涤细胞3次，每次离心1000×g10分钟。用1％台盼蓝染色法检测细胞活力并计数细胞。

5．如果细胞量较多（>10⁷），应当用上述淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，并用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

4）从小鼠胸腺中分离胸腺细胞

1．脱臼或剪头处死小鼠，置75％乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定，剪开小鼠胸腔，暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗净血液，去除结缔组织。

2．在有少量细胞培养液的平皿中，用镊子梳理胸腺，再用大口吸管反复吹打，分离单个细胞。离心沉淀细胞，用细胞培养液洗涤细胞1次。加入适量细胞培养液，静置5分钟，让大的组织块自然沉降，吸出单个胸腺细胞。

3．用1％台盼蓝染色法检测细胞活力，计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。