1. Thawvialquicklyin37癈water.Caution-vialcanexplode.
2. Transfercellstosterile,15mLcentrifugetube.
3. Add50祃warmFBS(fetalbovineserum,heatinactivated),wait1minute.
4. Add100祃FBS,wait1minute.
5. Add200祃FBS,wait1minute.
6. Add400祃FBS,wait1minute.
7. Add800祃FBS,wait1minute.
8. Centrifugefor5minutesat1000rpm.
9. Afteraspiratingsupernatant,resUSPendin5-6mLwarmmedia.
10. TransfertoT25(25cm²flask).
11. Incubateat37癈and5%CO₂withtopofflaskloose.
12. Nextday,checkthatcellsareviableandattached.Pourofforaspiratemedia.Add5-6mLfreshwarmmedia.
13. PassageintoT75whencellsbecomeconfluent(somecells,likeRCHO-1neverbecomeconfluent)

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